細胞轉染實驗中常見問題

一、轉染效率低

影響轉染效率因素很多，主要因素有細胞培養物、血清、載體構建、DNA質量以及轉染技術等。

1.沒有使用優化條件：優化陽離子脂質體試劑和DNA的量。

2.DNA-陽離子脂質體試劑復合物在存在血清條件下形成。

3.存在抑制劑：不要在用于制備DNA-陽離子脂質體復合物的培養基中使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素。透明質酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。

4.不恰當的細胞密度：轉染時融合度應為70%-90%。

5.陽離子脂質體試劑凍結：不要使用凍結的或儲存溫度低于4℃的陽離子脂質體試劑。

6.質粒純化的問題。

二、細胞死亡率高

1.DNA量太高

2.陽離子脂質體試劑量太高

3.在轉染過程中使用抗菌素：在轉染過程中不要使用氯霉素，青霉素或鏈霉素，因為陽離子脂質體試劑使細胞更敏感。

4.細胞太少

5.在無血清條件下細胞活性降低：使用OPTI-MEM培養基。確保在不存在血清的條件下形成復合物。

6.陽離子脂質體試劑被氧化：不要過分攪動或振蕩陽離子脂質體試劑，這可能會形成陽離子脂質體試劑的過氧化物。

7.對于穩定轉染，篩選抗生素加入的太快：在加入篩選性抗生素前至少預留24-48h使細胞表達抗性基因。   

細胞轉染注意事項

1.如為貼壁生長細胞，一般要求在轉染前一日，必須應用胰酶處理成單細胞懸液，重新接種于培養皿或瓶，轉染當日的細胞密度以70-90%（貼壁細胞）或2×106-4×106細胞/ml（懸浮細胞）為宜，最好在轉染前4h換一次新鮮培養液。

2.用于轉染的質粒DNA必須無蛋白質，無RNA和其他化學物質的污染，OD260/280比值應在1.8以上。

3.有血清時的轉染：

1）在開始準備DNA和陽離子脂質體試劑稀釋液時要使用無血清的培養基，因為血清會影響復合物的形成。其實，只要在DNA-陽離子脂質體復合物形成時不含血清，在轉染過程中是可以使用血清的。

2）陽離子脂質體和DNA的最佳量在使用血清時會有所不同，因此在轉染培養基中加入血清時需要對條件進行優化。

3）大部分細胞可以在無血清培養基中幾個小時內保持健康。對于對血清缺乏比較敏感的細胞，可以使用OPTI-MEM培養基，一種營養豐富的無血清培養基。

4.培養基中的抗生素

抗生素是影響轉染的培養基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉染效率降低。所以，在轉染培養基中不能使用抗生素。

對于穩定轉染，不要在選擇性培養基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素（穩定轉染常用的抗性篩選試劑）的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養基中細胞的健康生長，使用比含血清培養基更少的抗生素量。

5.設置陽性對照和陰性對照。

6.一般在轉染24-48h，靶基因即在細胞內表達。根據不同的實驗目的，24-48h后即可進行靶基因表達的檢測實驗。

7.如若建立穩定的細胞系，則可對靶細胞進行篩選，根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物，常用的真核表達基因載體的標志物有潮霉素和新霉素等。